Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen

Real-Time PCR

Bei der Real-Time PCR kann über Fluoreszenzfarbstoffe die Zunahme von PCR-Produkten in Echtzeit verfolgt werden. Häufig wird sie für quantitative Analysen verwendet (qPCR). Des Weiteren wird sie zum Nachweis bekannter Polymorphismen oder Mutationen eingesetzt. Dabei erfolgt die Detektion über sequenzspezifische Sonden-Hybridisierung und Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET). Die Bestimmung des Genotyps erfolgt durch eine Schmelzkurvenanalyse (LightCycler®) oder Dot-Blot-Analyse (TaqMan®).

Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Für die Quantifizierung von Genabschnitten oder Transkripten findet die Real-Time-PCR Anwendung. Häufig verwendete Geräte sind LightCycler (Roche), LightCycler 480II (Roche), Taqman 7900HT (Life Technologies) und ViiA7 (Life Technologies). In diesen Geräten findet die Detektion von PCR-Produkten über Fluoreszenzsignale statt, entweder sequenzunspezifisch (z.B. über SYBR Green) oder sequenzspezifisch mittels fluoreszenzmarkierter Sonden. Die Anregung erfolgt über Laser, LED- oder Halogen-Lampen. Bei der sequenzspezifischen Detektion werden Sonden eingesetzt, die zu einem Abschnitt der zu analysierenden DNA bzw. cDNA komplementär sind. Die Zunahme des Fluoreszenzsignals im Verlauf der Reaktion ist proportional zur Menge des entstehenden PCR-Produkts und kann im Verlauf der Reaktion in Echtzeit verfolgt werden.

Durch die qPCR können z.B. chromosomale Fusionsgene bzw. deren Transkripte, die bei vielen Leukämie- und Lymphomformen entstehen, analysiert werden, was für das Monitoring der Erkrankung eine wichtige Rolle spielt. Hierdurch kann z.B. das Ansprechen auf die Behandlung einer BCR-ABL-positiven Leukämie mit Imatinib oder einer PML/RAR?-positiven Promyelozyten-Leukämie mit ATRA überwacht werden. Auch aberrante Zellklone im Sinne einer Minimal Residual Disease (MRD) können sehr sensitiv detektiert werden.

Prinzip des 5'-3' Nuklease-Assays (AB7900HT). Die TaqMan Sonde, die an die Zielsequenz zwischen den beiden PCR-Primern hybridisiert, enthält einen Reporter-Farbstoff am 5’-Ende und einen Quencher-Farbstoff am 3’-Ende. Die räumliche Nähe von Reporter und Quencher supprimiert die Fluoreszenz. Während der PCR-Reaktion wird durch die 5’-3’ Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase die Sonde vom 5’ Ende her von der Zielsequenz verdrängt und der Reporter vom Quencher getrennt. Erst jetzt kann die Fluoreszenz des Reportermoleküls detektiert werden. Die Zunahme der Intensität der Fluoreszenz ist proportional zu der Entstehung von PCR-Produkten.


LightCycler®-Technologie

Der Nachweis bekannter Polymorphismen und Mutationen mittels Lightcycler®-Technologie erfolgt aus genomischer DNA durch PCR-Amplifikation, Sondenhybridisierung und anschließender Schmelzkurven-Analyse. Für die Detektion von Varianten wird jeweils ein Fluoreszenz-markiertes Sondenpaar benötigt, das aus einer Donor- und einer Akzeptorsonde besteht. Deren Sequenz ist so gewählt, dass sie in geringem Abstand nebeneinander an das PCR-Fragment binden. Dabei kommt das Fluorescein-Molekül der Akzeptor-Sonde in räumliche Nähe des Fluoreszenzfarbstoffs der Donor-Sonde (z.B. LC-Red640). Nach Anregung des Fluoresceins bei 470 nm wird die Energie durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Transfer (FRET) auf den benachbarten Farbstoff übertragen, der dann bei seiner charakteristischen Wellenlänge Fluoreszenzsignale emittiert. Diese sind messbar, solange beide Sonden an die Komplementärsequenz gebunden sind. Die Bestimmung des Genotyps erfolgt durch eine Schmelzkurvenanalyse. Dazu wird nach Ablauf der PCR-Reaktion die Temperatur im Ansatz schrittweise erhöht, so dass die Sonden abschmelzen. Dadurch wird der Fluoreszenz-Resonanz-Transfer unterbrochen und die Fluoreszenzemission nimmt ab. Der Verlust des Lichtsignals bei einer spezifischen Temperatur wird zur Bestimmung des Genotyps herangezogen. Da bei Fehlpaarung einer Base die Sonde früher abschmilzt als bei vollständig homologer Basenpaarung, weichen die Schmelztemperaturen zwischen den verschiedenen Genotypen voneinander ab. Der homozygote Wildtyp-Genotyp (wt/wt) bzw. der homozygot-variante Genotyp (mut/mut) weist nur einen Schmelzkurvenpeak auf, der heterozygote Genotyp (wt/mut) zeigt beide Signale (siehe Abbildung Mitte).

Darstellung des Prinzips und der Genotyp-Bestimmung mittel LightCycler<sup>®</sup>-Technologie
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LightCycler 480II: mit der neuen LC 480II-Technologie ist es möglich 96 Proben in einem Ansatz zu untersuchen (mit freundlicher Genehmigung der Fa. Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland).


TaqMan®-Assay (Exonuklease Assay)

Ein weiteres Verfahren zum Nachweis bekannter Einzelnukleotid-Austausche oder Punktmutationen ist die allelspezifische Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden (allelspezifische Oligonukleotidhybridisierung oder ASO). Bei dieser Technik wird der PCR sowohl eine Wildtyp- als auch eine mutationsspezifische Sonde zugesetzt, deren Fluoreszenz erst sichtbar wird, nachdem die zuvor spezifisch gebundene Sonde durch die DNA-Polymerase im Zuge der Strang-Elongation abgebaut wurde, und das Fluoreszenzmolekül freigesetzt wird . Je nachdem, ob der Wildtyp oder die Variante/Mutation vorliegt, erhält man unterschiedliche Farbsignale, welche nach Anregung durch Laserlicht in einer Photozelle detektiert werden. Die Genotypbestimmung erfolgt mittels Dot-Blot-Analyse.

Prinzip des Exonuklease-Assays
Auswertung von Fluoreszenzsignalen eines Exonuklease-Assays durch Softwaregestütztes “Allele Calling”