Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen

Oligonukleotid-Ligation-Assay (OLA)

Der Oligonukleotid-Ligation-Assay wird in der Routine vorwiegend für die Analyse eines Mutationspanels in der Mukoviszidose-Diagnostik eingesetzt. In einer Multiplex-PCR werden 16 Zielregionen des CFTR-Gens amplifiziert. Die PCR-Produkte aus der Multiplex-PCR dienen als Ausgangsmoleküle für eine Ligations-Reaktion, die durch Zugabe eines OLA-Reagenz gestartet wird. Das OLA-Reagenz enthält Oligonukleotide, welche teilweise fluoreszenzmarkiert sind, sowie eine DNA-Ligase. Bei der Reaktion werden 3 Sondentypen eingesetzt: a) eine gemeinsame (“common”) Sonde, die am 3`-Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff (blau, grün oder gelb) markiert ist, b) 29 wildtypspezifische Sonden und c) 33 mutationsspezifische Sonden. Die gemeinsame Sonde bindet an die Zielsequenz unabhängig davon, ob eine Wildtyp- oder mutante Sequenz vorliegt. Die Wildtyp- und Mutationssonden unterscheiden sich nur durch ein Nukleotid am 3`-Ende. Am 5`-Ende von Wildtyp- und Mutationssonde hängt jeweils ein sog. PEO-Molekül, dessen Länge spezifisch für jede nachzuweisende Zielsequenz ist. Die Wildtyp- und Mutationssonden konkurrieren um die Bindungsstelle an die Zielsequenz, wobei nur die Sonde bindet, die exakt mit der Zielsequenz komplementär ist. Liegt keine der 33 zu analysierenden Mutationen vor, binden nur die Wildtypsonden. Ist eine Mutation homozygot vorhanden, bindet nur die Mutationssonde. Bei Heterozygotie binden sowohl Wildtyp- als auch Mutationsonde an die Zielsequenz. Die DNA-Ligase verknüpft die gemeinsame und Wildtyp- oder Mutationssonde nach Hybridisierung an die Zielsequenz. Jedes Ligationsprodukt kann nun über seine spezifische Länge und die unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung der gemeinsamen Sonde kapillarelektrophoretisch nachgewiesen werden.

Prinzip des Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) mit Wildtyp DNA (oben) und mutanter DNA (unten). Die verschiedenen OLA-Produkte werden mittels Kapillarelektrophorese separiert und durch Fluoreszenzfarbstoffe sichtbar gemacht.