Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)

Die MLPA zur Detektion von Dosisunterschieden von bis zu 50 verschiedenen Nukleinsäurefragmenten in einem Ansatz wurde erstmals 2002 beschrieben (Schouten et al., Nucl Acids Res 30:12e57). In dieser Arbeit wurde die Kopienzahl von 40 Loci im menschlichen Genom durch simultane relative Quantifizierung bestimmt. Die Menge der sequenzspezifisch hybridisierten und ligierten Oligonukleotide ist dabei proportional zur Kopienzahl der Ziel-Sequenz. Die Amplifikationsprodukte werden anschließend durch Kapillarelektrophorese nach Größe getrennt. Dosisunterschiede sind durch Reduktion oder Vergrößerung der Peakhöhen und -flächen erkennbar. Mittlerweile sind mehr als 300 verschiedene MLPA-Kits zur Detektion von Deletionen/Duplikationen einzelner Exons von Genen, Genbereichen, ganzer Gene, Chromosomenbereiche und ganzer Chromosomen kommerziell verfügbar (z.B. von MRC-Holland). Inzwischen wurden auch Varianten des Grundprinzips entwickelt: RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA), die für mRNA Profiling eingesetzt wird; Methylierungsspezifische MLPA (MS-MLPA), die sowohl zur Bestimmung der Kopienzahl als auch zur Analyse des Methylierungsmusters (Detektion von Imprinting-Defekten) und zur Analyse von Tumoren eingesetzt wird.

Prinzip der MLPA, die in vier Schritten erfolgt: (1) DNA-Denaturierung und Hybridisierung der MLPA-Proben, (2) Ligations- Reaktion, (3) PCR, (4) Trennung der Amplifikationsprodukte durch Elektrophorese. Jede der bis zu 50 MLPA-Proben in einem Ansatz besteht aus einer “Target”spezifischen Sequenz, einer “Stuffer”-Sequenz definierter Länge, und einer M13-Universal-Primersequenz. Die Multiplex-Amplifikation mit einem Fluoreszenz-markierten M13-Primerpaar kann nur nach Ligation der hybridisierten Proben erfolgen. Durch das Design der unterschiedlich langen “Stuffer”-Fragmente ist eine Trennung von Fragmenten einer Länge zwischen 130 und 480 bp möglich.



Trennung der Amplifikationsprodukte durch Kapillarelektrophorese. Im unteren Teil sind die spezifischen Signale für die Exons 1 - 21 des <i>TSC2</i>-Gens (gekennzeichnet durch rote Sterne) im Vergleich zur Kontroll-DNA (oberer Teil) um die Hälfte reduziert, was einer heterozygoten Deletion entspricht.



Relative Quantifizierung der Gen-spezifischen Amplifikationsprodukte. Anhand der im gleichen Ansatz mitgeführten, für andere chromosomale Regionen spezifischen Kontrollproben (grüne Balken rechts) ist eine Dosisreduktion der Exons 1 - 21 auf die Hälfte erkennbar. Dies entspricht einer heterozygoten Deletion in diesem Bereich. Die Quantifizierung kann durch Export der Signalhöhen und -flächen in ein Excel-basiertes Programm oder über eine spezielle MLPA-Auswerte-Software erfolgen.