Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen

Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Chromatographie beschreibt die Auftrennung eines Stoffgemisches in seine Einzelteile, die durch unterschiedliche Wechselwirkungen zwischen einer mobilen und einer stationären Phase zustande kommt. Bei der Flüssigkeitschromatographie (High Pressure Liquid Chromatography = HPLC) liegt das Analytgemisch in gelöster Form vor und wird über eine mit festen Partikeln gepackte Chromatographiesäule getrennt. Damit die Probe überhaupt über die Säule transportiert wird, erfolgt die Auftrennung unter erhöhtem Druck (100-300 bar).

Geräteaufbau:

In Vorratsbehältern befinden sich verschiedene Laufmittel (organische oder wässrige Lösungsmittel und Puffer), die die mobile Phase darstellen. Diese Laufmittel werden mit Hilfe einer Hochdruckpumpe mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit über die Säule befördert. In einem Mischer werden die Lösungsmittel miteinander vermischt, so dass beliebige Laufmittelzusammensetzungen hergestellt werden können, die sich auch während eines Trennlaufes in einem bestimmten Verhältnis verändern können (Gradiententrennung). Der sogenannte Autosampler injiziert ein definiertes Volumen der vorbereiteten Probe in die HPLC-Anlage. Die Probe wird durch die mobile Phase zur Säule transportiert und über verschiedene Wechselwirkungen getrennt. Nach der Säule gelangen die einzelnen Komponenten zum Detektor, der das chemische Signal in ein elektrisches umwandelt und dieses an die Auswerteeinheit weitergibt. Bei der herkömmlichen HPLC Technik werden hier vor allem optische Detektoren wie UV/VIS- oder Fluoreszenzdetektoren eingesetzt. Die Wahl des Detektors hängt von den Eigenschaften der Analyte ab, die entweder UV-Licht absorbieren können bzw. fluoreszierende Strahlung abgeben. Die vermessenen Proben werden in einem Abfallbehälter gesammelt, während die Software ein Chromatogramm generiert.

Schematische Darstellung eines HPLC Systems (von links nach rechts): Lösungsmittelbehälter mit mobiler Phase, Hochdruckpumpe, Gradientenmischer, Injektionseinheit und Probeneinlasssystem, Chromatographische Trennsäule, Detektor, Chromatogramm und Abfallbehälter. Bildmaterial mit freundlicher Genehmigung der Fa. Waters (Milford, MA, U.S.A.)


Trennprinzip:

Die Probe (im Beispiel ein schwarzes Gemisch aus den Einzelfarben Gelb, Rot und Blau) wird am einen Ende der chromatographischen Trennsäule injiziert. Die Säule, die mit kleinen, festen Partikeln gepackt ist, wird mit der mobilen (sich bewegenden) Phase durchspült, wodurch das Gemisch kontinuierlich durch die Säule wandert. Aufgrund ihrer chemischen Struktur besitzen die Analyten unterschiedliche Polaritäten, durch welche verschiedene Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und der mobilen bzw. der stationären Phase hervorgerufen werden. Je nach chemischer Kompatibilität hat der Analyt eine höhere Affinität zur mobilen oder zur stationären Phase.

In der oberen Abbildung wandert der gelbe Stoff am schnellsten durch die Säule, da seine Interaktion mit der mobilen Phase stärker ist als mit der stationären Phase. Daher bewegt er sich öfters im konstanten Fluss des Laufmittels mit und gelangt als erstes zum Detektor. Die blaue Substanz hingegen tritt vermehrt mit der stationären Phase in Wechselwirkung, weshalb sie mehr Zeit braucht, um von der mobilen Phase über die Säule und zum Detektor transportiert zu werden. Blau eluiert zu einem späteren Zeitpunkt als Gelb. Durch Variation der Laufmittelzusammensetzung kann die Trennung eines komplexen Stoffgemisches optimiert werden.

Der zeitliche Verlauf der Trennung wird in einem Chromatogramm wiedergegeben. Die Retentionzeit der Probe (Verweildauer auf der Säule) wird gegen die Signalintensität, die der Detektor misst, aufgetragen. Das detektierte Messsignal ändert sich proportional zur Analytkonzentration. Die resultierenden Peaks im Chromatogramm beschreiben den Verlauf einer Gauß'schen Glockenkurve. Für die Auswertung der Daten werden die Peakflächen integriert und mit Flächeninhalten von zuvor vermessenen Proben mit bekannten Konzentrationen verglichen (Kalibration).

Die hier im Labor verwendete UPLC Technik (Ultra Performance Liquid Chromatographie) basiert auf den Prinzipien der  HPLC, jedoch können durch  kleinere Säulenpartikel und höhere Gesamtdrücke (bis 1000 bar) verbesserte Trennleistungen bei kürzerer Analysenzeit erzielt werden.