Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen

Festphasenextraktion (SPE)

Der Einsatz von Massenspektrometern mit vorheriger chromatographischer Trennung (LC-MS/MS) im Bereich der klinischen Analytik hat in den letzten Jahren stets zugenommen. Einhergehend mit dieser hochsensitiven Messtechnik ist die Notwendigkeit einer guten Probenvorbereitung, da unbehandelte Vollblut- oder Serumproben nicht in diese Apperaturen injiziert werden können.

Die einfachste und schnellste, gleichzeitig aber auch gröbste Art der Probenvorbereitung ist die Proteinfällung durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln. Diese Art der Aufarbeitung ist in vielen Fällen aber nicht ausreichend, da neben Proteinen viele andere Störsubstanzen in der Matrix enthalten sind die auf diese Art nicht abgetrennt werden können.

Die deutlich effektivere Art der Probenvorbereitung ist die sogenannte Festphasenextraktion (Solid Phase Extraktion = SPE). Die grundlegenden Prinzipien der SPE sind mit denen der Flüssigkeitschromatographie zu vergleichen. Ein Analytgemisch wird auf eine SPE Kartusche gegeben, die mit Partikeln einer speziellen chemischen Struktur gefüllt sind. Im Idealfall geht der Analyt eine Wechselwirkung mit dieser festen Phase ein, während Störkomponenten ungehindert eluieren. Durch verschiedene Waschschritte mit unterschiedlich starken organischen Lösungsmitteln, bzw. Lösungen unterschiedlicher pH Werte können weiterhin unerwünschte Probenkomponenten entfernt werden. Zum Schluss wird der Analyt mit einem geeigneten Elutionsmittel von der Kartusche gelöst und kann in die LC-MS/MS Anlage injiziert werden.

Aufreinigung einer Probe mittels Festphasenextraktion: Das Probengemisch (schwarz) wird auf die SPE-Kartusche gegeben. Die einzelnen Komponenten gehen spezielle Wechselwirkungen mit der festen Phase ein und werden unterschiedlich stark retardiert. Durch verschiedene Waschschritte werden die einzelnen Komponenten nacheinander von der Kartusche eluiert, wobei am Ende nur noch der Analyt vorhanden ist. Bildmaterial mit freundlicher Genehmigung der Fa. Waters (Milford, MA, U.S.A.)


Vorallem in den folgenden Fällen findet die SPE Anwendung: 

1. Aufkonzentrierung des Analyten: 

Analyte wie z.B. bestimmte Hormone liegen im Serum in so geringen Konzentrationen vor, dass es auch für sensitive Massenspektrometer schwer wird, diese zu detektieren. Um diese kleinen Mengen quantifizieren zu können, ist es möglich den Analyt auf einer SPE-Kartusche anzureichern. Als Beispiel könnte 1 ml Serum als Ausgangsmaterial für die SPE verwendet werden. Die in diesem Volumen enthaltene Analytmenge wird vollständig auf der Kartusche resorbiert, um am Ende in 100 µl Lösungsmittel eluiert zu werden. Der Analyt konnte um das 10-fache aufkonzentriert werden. Unter geeigneten Bedingungen sind Anreicherungsfaktoren von mehr als 20 möglich.

2. Abtrennung von Störkomponenten

Vor allem bei LC-Methoden mit optischen Detektoren (UV, FLD) kann es sein, dass im Chromatogramm störende Peaks auftreten. Durch parallel eluierende Substanzen wird das Analytsignal teilweise überlagert, komplett verdeckt oder so stark minimiert, dass eine eindeutige Auswertung nicht möglich ist. Mit vorheriger SPE können diese störenden Substanzen in einem der Waschschritte entfernt werden, woraus ein klareres Analytsignal resuliert.

3. Minimierung der Matrixeffekte: 

Matrixeffekte sind vor allem beim Einsatz von Massenspektrometern als Detektor ein gängiges Problem. Hierbei handelt es sich, anders als bei Störkomponenten, um im Chromatogramm nicht sichtbare Peaks. Matrixeffekte sind nur im direkten Vergleich zwischen einer reinen Standardlösung und einer matrixbelasteten Probe zu erkennen. Weist das Serum Matrixeffekte auf, wird eine Lösung derselben Konzentration wie die Reinsubstanz deutlich geringere Peakintensitäten zeigen. Dies ist ein Indikator dafür, dass im Serum unbekannte Faktoren enthalten sind, die die Ionisierung des Analyten im Massenspektrometer herabsetzen. Mit Hilfe eines geeigneten SPE Protokolles können diese Substanzen abgereichert werden, wodurch die Signalintensität deutlich erhöht wird und die Nachweisgrenze des gesamten Verfahrens verbessert wird.