Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen

Cell Free DNA (cfDNA) Analyses

DNA ist hauptsächlich im Kern von Zellen lokalisiert, wo sie in linearer Form in Proteinkomplexen vorliegt. Für die Analyse dieser DNA ist ein Zellaufschluss mit anschließender DNA-Aufreinigung notwendig. Im Blutkreislauf eines jeden Menschen findet sich jedoch auch DNA, die nicht in Zellkernen verpackt vorliegt, sondern in zellfreier Form vorhanden ist. Diese zellfreie DNA (engl. cell free DNA; cfDNA) kann durch eine einfache Blutplasmaextraktion ohne Zelllyse gewonnen werden.

cfDNA im Blut stammt aus dem ubiquitär stattfindenden programmierten Zelltod (Apoptose) im menschlichen Körper, durch den genomische DNA zuerst fragmentiert und später sekretiert wird. Neben Fettzellen (Adipozyten) durchlaufen auch fetale Trophektodermzellen, eventuell vorhandene Tumorzellen und Transplantatzellen die Apoptose und sind somit in der cfDNA repräsentiert. Diese Fraktion der „Fremd“-cfDNA kann trotz ihres geringen Anteils im Blut auf fetale Aneuploidie, krebsspezifische Mutationen und Graft-versus-Host-Disease (GvHD) analysiert werden.

Folgende Methoden werden derzeit dazu verwendet:

Real-time PCR

Nachweis von Punktmutationen durch Allel-spezifische Sonden, speziell bei Genen auf dem Y-Chromosom und Nachweis von Duplikationen/Deletionen durch relative Quantifizierung.

Digital-PCR

Diese PCR-Form bedient sich der Mikrofluidik, die eine limitierende Verdünnung des Ausgangsmaterials erzeugt.  Dadurch  wird  eine  sehr  hohe  Sensitivität gewährleistet, die im Rahmen der cfDNA-Analyse eine absolute Quantifizierung erlaubt. Eine Unterscheidung zwischen mütterlicher und fetaler cfDNA ist damit möglich. Sie dient zum Nachweis von Punktmutationen, Kopienzahlvariationen (CNV), Heterozygotie-Verlust und Aneuploidie.

Shotgun-Sequencing

Wie die Digital-PCR eignet sich die Shotgun-Sequenzierung auch zum Nachweis von Punktmutationen, Kopienzahlvariationen (CNV), Heterozygotie-Verlust und Aneuploidie. Die Gesamtgenom-Sequenzierung eines fetalen Genoms ist ebenso möglich.

Massenspektrometrie

Mittels MALDI-TOF MS können Punktmutationen in cfDNA sequenziert werden. Dazu hybridisiert ein Oligonukleotid direkt vor der Punktmutation und wird um ein einzelnes Nukleotid verlängert (sog. Einzelnukleotid-Sequenzierung). Durch die Detektion von Massenunterschieden können homozygote und heterozygote Basenpaarpositionen unterschieden werden.