Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen

Molekulare Karyotypisierung (Chromosomale Microarray-Analysen, CMA)

Array-CGH-Technik

Als weiterführende Methode zum Nachweis chromosomaler Imbalancen (copy number variants, CNV’s) hat in den letzten Jahren die Array-CGH (komparative genomische Hybridisierung) oder molekulare Karyotypisierung in die Diagnostik Einzug gehalten. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, das ähnlich wie die FISH-Diagnostik auf einer Hybridisierung basiert. Die Array-CGH erfasst aber - wie die Chromosomenanalyse - das gesamte Genom, jedoch mit einer wesentlich höheren Auflösung, die in der Routinediagnostik mittlerweile unter 200 kb liegen sollte. Das Prinzip der Array-CGH basiert auf dem Einsatz von kurzen Oligonukleotiden, welche auf einer Matrix immobilisiert vorliegen. Diese decken repräsentativ das gesamte Genom ab, wobei die mittlere Auflösung vom Array-Typ und der Gesamtzahl an Oligonukleotiden abhängt. Die Oligonukleotide tragen zum Genom komplementäre Sequenzen, an welche eine Patienten-DNA und eine Referenz-DNA kompetitiv hybridisieren können. Durch diese vergleichende Hybridisierung können sehr kleine, submikroskopische Veränderungen (Deletionen, Duplikationen) beim Patienten nachgewiesen und durch den Einsatz spezieller Softwareprogramme die an den Veränderungen beteiligten Gene identifiziert werden.

Balancierte Translokationen, Inversionen  und Insertionen sowie geringgradige Mosaike können mit der Array-CGH allerdings nicht detektiert werden. Die Array-CGH kann die klassische Zytogenetik und Tumorzytogenetik daher nicht ersetzen, aber sinnvoll ergänzen.

CGH+SNP-Array-Technik

Durch den Einsatz polymorpher Oligonukleotide („SNP-Marker“) in  Kombination mit den  nicht-polymorphen Oligonukleotiden der Array-CGH-Technik wird neben dem Nachweis von Deletionen und Duplikationen auch die Detektion von Kopienzahl-neutralen Veränderungen, sog. Loss-of-Heterozygosity (LOH)/uniparentale Disomien (UPD) ermöglicht. Bei den Kopienzahl-neutralen Veränderungen können ganze Chromosomen oder auch nur Teilstücke verloren gehen, und die noch vorhandene Kopie wird zum Ausgleich des Verlusts als Vorlage genutzt und dupliziert. Dies kann dazu führen, dass defekte Allele verdoppelt werden und diese trotz des Vorhandenseins der genetischen Information nicht genutzt werden können, da sie ihre Funktionsfähigkeit verloren haben. Ein weiterer Vorteil dieser kombinierten Technik besteht in der höheren Sensitivität beim Nachweis von Mosaiken.

Derzeit werden in unserem Labor hauptsächlich zwei Array-Plattformen genutzt - Arrays der Firma BlueGnome sowie der Firma Affymetrix. Bei den 180k Oligo-Arrays (BlueGnome) mit einem durchschnittlichen Sondenabstand von 16 kb werden eine Patienten- und eine Referenz-DNA mit 2 unterschiedlichen Farbstoffen markiert und auf dem Array hybridisiert. Beide markierte DNAs werden dann vergleichend genomisch hybridisiert und mittels Laser-Scanner wird das Verhältnis der Fluoreszenzsignale der Patienten- und Referenz-DNA ausgelesen. Eine Software-basierte Auswertung ermöglicht den Nachweis von Deletionen oder Duplikationen in der Patienten-DNA im Vergleich zur normalen Referenz-DNA. Bei den 2,7M-Arrays (CytoScan HD, Affymetrix) mit einem durchschnittlichen Sondenabstand von 1,1 kb wird lediglich die Patienten-DNA farblich markiert, auf den Array hybridisiert und die Fluoreszenzsignale ausgelesen. Die komparative genomische Hybridisierung erfolgt dann in silico während der Software-basierten Auswertung.

Prinzip der Array-CGH: eine 1:1-Mischung aus Patienten- und Referenz-DNA, die zuvor mit 2 unterschiedlichen Farbstoffen markiert wurden, wird auf einer Matrix mit immobilisierten DNA-Sonden hybridisiert. Ein Laser-Scanner detektiert die sich ergebenden Fluoreszenzsignale und die Software-basierte Auswertung ermöglicht den Nachweis von Deletionen oder Duplikationen in der Patienten-DNA im Vergleich zur normalen Referenz-DNA.
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Zytogenetik

Postnatale Diagnostik

Die Anwendung der Microarray-Technik insbesondere bei Kindern mit isolierter Intelligenzminderung oder komplexen Retardierungs- und Fehlbildungssyndromen hat zahlreiche neue Mikrodeletions- und Mikroduplikationssyndrome definiert, die vor einigen Jahren noch völlig unbekannt waren. Durch den Einsatz der Array-CGH in der Routinediagnostik können nun vermehrt submikroskopisch kleine Imbalancen gefunden werden, die als ursächlich für Mentale Retardierung (MR)/Entwicklungsverzögerung und ggf. weitere Symptome angesehen werden müssen. Auch Störungen aus dem autistischen Formenkreis, die nicht selten eine MR zeigen, gehen gehäuft mit bestimmten Kopienzahlveränderungen einher, so dass auch diese Erkrankungen eine Indikation zur molekularen Karyotypisierung darstellen.

XY: SNP-Array: UPD7q (7q31.33qter, 34Mb) bei einem Patienten mit MDS. Die weighted log2 ratio zeigt einen Kopienzahl-neutralen Status während die Auftrennung der Allel peaks in die homozygoten Allele AA und BB eine Loss of Heterozygosity im Sinne einer Uniparentalen Disomie (UPD) nachweist.


Pränatale Diagnostik

Die Array-CGH kann in der Pränataldiagnostik als sinnvolle Ergänzung zur zytogenetischen Routinediagnostik bei einem auffälligen fetalen Ultraschall und normaler Chromosomenanalyse sowie zur Charakterisierung einer neu entstandenen chromosomalen Strukturaberration beim Feten hinzugezogen werden.

Aneuploidie- und Translokationsdiagnostik bei PKD/PID

Die auf dem 24Sure Mikrochip basierte komparative, genomische Hybridisierung erlaubt den Nachweis von Fehlverteilungen aller 24 Chromosomen aus einer einzigen Zelle. Um ein robustes Ergebnis zu erreichen, sind auf den hier verwendeten Mikrochips größere Sonden (BAC-Klone) gespottet. Auch komplexe Aneuploidien mit Beteiligung von mehr als 3 Chromosomen/Chromatiden können zuverlässig detektiert werden. Durch Verwendung der 24Sure+ Mikrochips mit höherer Abdeckung im Telomerbereich der Chromosomen ist es zudem möglich, auf verschiedenste, unbalancierte Translokationen und Fehlverteilungen aller 24 Chromosomen gleichzeitig zu überprüfen. Für numerische und für strukturelle, chromosomale Aberrationen können sowohl die Polkörper der Eizelle als auch Trophektoderm-Zellen der Blastozyste als Untersuchungsmaterial dienen. Welches der beiden Untersuchungsmaterialien verwendet werden kann, muss von Fall zu Fall entschieden werden und hängt von der genetischen Disposition der Patienten ab.

Molekulare Onkologie

Mit Hilfe eines Arrays, der vor allem diejenigen Genregionen hochauflösend darstellt, die bei hämatologischen Neoplasien häufig Veränderungen aufweisen, können Deletionen und Amplifikationen einzelner Abschnitte des Erbguts in Blut- bzw. Knochenmarkproben identifiziert werden. Durch den gesamtgenomischen Ansatz werden auch solche Veränderungen nachgewiesen, die mit dem üblicherweise eingesetzten FISH-Panel nicht detektierbar sind. Weiterhin können komplexere Chromosomenveränderungen charakterisiert werden und durch den Einsatz hochauflösender Arrays Bruchpunktregionen, die in einer Chromosomenanalyse nachgewiesen wurden, genauer bestimmt werden. Mit Hilfe der SNP-Arrays können auch LOH-(loss of heterozygosity) bzw. UPD-(uniparentale Disomie)-Regionen gefunden werden. Zellkulturprobleme oder Kulturartefakte werden somit umgangen.

Nachweis einer 1,6 Mb großen Mikrodeletion 15q13 (roter Pfeil) bei einer Patientin mit Autismus und Intelligenzminderung; im Falle der Amplifikation 15q11.2 (grüner Pfeil) handelt es sich um eine benigne Variante.
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Literatur

Qiao Y et al, Clin Genet 83:145 (2012) / Hanemaaijer NM et al, Eur J Hum Genet 20:161 (2012) / Shaffer LG et al, Prenat Diagn 32:976 (2012) / Cooper GM et al, Nature Genet 43(9):838 (2011) / Shaffer LG et al, Prenat Diagn 32:344 (2012) / Hochstenbach R et al, Eur J Med Genet 52:161 (2009) / Handyside AH et al,  Eur  J  Hum  Genet  20:742  (2012)  / Geraedts, J. et al., Human Reproduction (2011) / Magli, M. C. et al. Human Reproduction (2011)